本篇文章给大家谈谈引物设计，以及引物设计软件primer对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。
引物设计原则
引物设计有 3 条基本原则：
引物与模板的序列要紧密互补。
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物设计
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
设计要求
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
避免重复碱基，尤其是G。
Tm=58-60度。
GC=30-80%。
3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。
正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
引物的退火温度要高，一般要在60度以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，更好度是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的全部物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
如何设计引物?
2.在框中粘贴入你的原始序列(要比你要扩的目的片段两端延伸一点)
3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定
4.点击"pickup primers"就会出现下一页,上面会列出多种设计,一般来说,第一对引物是最适合的.
同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
(1) 引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高.太长则比较浪费,且难以合成.
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).
(3) 四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发.
(4) 引物3'端更好度与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对.
(5) 在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构.
两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量.两引物间更好度不存在4个连续碱基的同源性或互补性.
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基.
引物不与模板结合位点以外的序列互补.所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量.
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性.否则可能由于产量低而看不见扩增产物.
引物设计原则是什么?
引物设计的原则是：
1、引物更好度在模板cDNA的保守区内设计。
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
3、引物GC含量在40%-60%之间，Tm值更好度接近72℃。
4、引物3′端要避开密码子的第3位。
5、引物3′端不能选择A，更好度选择T。
6、碱基要随机分布。
7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。
8、引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
9、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
10、扩增产物的单链不能形成二级结构。
11、引物应具有特异性。
常用引物设计软件
1、Oligo 6
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；对环型DNA片段，设计反向PCR引物；设计多重PCR引物。
2、Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。
引物设计的引物设计原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值更好度在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
扩展资料：
引物设计是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0。
参考资料来源：百度百科-引物设计
引物的设计原则
引物设计原则
1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的更佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
2、G十C含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。
8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。
扩展资料
引物合成
1、是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。
2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
3、带帽(c *** ing)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。
4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
参考资料来源：百度百科—引物设计
引物设计原则是什么？
原则：
①引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp（注意此处所指的长度是结合到模板的长度，不包括5'端加修饰后的长度），过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。上下游引物长度差不超过4 bp，Tm差不超过2℃。
②引物序列在模板其他位置应当没有相似性较高的序列，尤其是3端，否则容易导致错配。引物3端避免出现3个以上的连续碱基如GGG或CCC。
③引物3端的末位碱基对Taq酶合成效率有较大影响，末位碱基为A的错配率明显高于其他碱基，应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
④引物序列的GC含量一般为40-60%。GC含量过低，则AT含量高，与模板结合能力低；GC含量过高，容易产生二级结构，也不利于结合模板。上下游引物的GC含量不能相差太大。
⑤引物Tm值范围为55-65℃。Tm值与PCR反应的退火温度相关，退火温度高，引物结合到模板的能力就差（但特异性好）；退火温度低，引物结合到模板的能力就强（但特异性差，非特异性产物多）。
因此，如果想提高PCR反应的特异性，可以将引物的Tm设计得高一点，这样就可以把PCR的退火温度相应设定得高一点。Tm值的计算有多种方法，长度在25 nt以内的引物可采用公式粗略计算：Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。
引物设计的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于引物设计软件primer、引物设计的信息别忘了在本站进行查找喔。
